一文看懂穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜原理與應(yīng)用

一、熒光光譜儀介紹

穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜

1、原理

在吸收紫外和可見(jiàn)電磁輻射的過(guò)程中，分子受激躍遷至激發(fā)電子態(tài)，大多數(shù)分子將通過(guò)與其它分子的碰撞以熱的方式散發(fā)掉這部分能量，部分分子以光的形式放射出這部分能量，放射光的波長(zhǎng)不同于所吸收輻射的波長(zhǎng)。后一種過(guò)程稱(chēng)作光致發(fā)光。

分子發(fā)光包括 熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等?；诨衔锏臒晒鉁y(cè)量而建立起來(lái)的分析方法稱(chēng)為 分子熒光光譜法。

被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀。一個(gè)激發(fā)，一個(gè)發(fā)射，采用雙單色器系統(tǒng)，可分別測(cè)量激發(fā)光譜和熒光光譜。目前國(guó)內(nèi)外熒光光譜儀示意圖如圖一：

圖一 熒光光譜儀原理示意

2、分類(lèi)

熒光光譜儀是測(cè)定材料發(fā)光性能的基本設(shè)備。通用熒光光譜儀大致可分為3種：

(1) 基本型：在200-800 nm的紫外可見(jiàn)波段的穩(wěn)態(tài)光譜儀。

(2) 擴(kuò)展型：覆蓋200-1700 nm波段的紫外可見(jiàn)-近紅外穩(wěn)態(tài)光譜儀。

(3) 綜合型：覆蓋上述兩個(gè)波段，同時(shí)可測(cè)瞬態(tài)光譜的光譜儀。

3、主要部件

光源：提供不同波長(zhǎng)的激發(fā)光

單色器：激發(fā)單色器將光源發(fā)出的復(fù)色光變成單色光，發(fā)射單色器將發(fā)出的熒光與雜散光分離，防止雜散光對(duì)熒光測(cè)定產(chǎn)生干擾。

狹縫：控制光通量

檢測(cè)器：光電倍增管

樣品池：四面透明正方形石英池，長(zhǎng)1cm，寬1cm

測(cè)試儀器：穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜

4、主要用途

（1）熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜

（2）同步熒光（波長(zhǎng)和能量）掃描光譜

（3）3D（Ex Em Intensity)

（4）Time Base和CWA(固定波長(zhǎng)單點(diǎn)測(cè)量）

（5）熒光壽命測(cè)量，包括壽命分辨及時(shí)間分辨

（6）計(jì)算機(jī)采集光譜數(shù)據(jù)和處理數(shù)據(jù)（Datamax和Gram32)

穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜的應(yīng)用領(lǐng)域

二、熒光與磷光

1、熒光與磷光現(xiàn)象

2、熒光與磷光產(chǎn)生原理

熒光：第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)

磷光：第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)

3、激發(fā)與發(fā)射光譜

任何熒光化合物都具有兩個(gè)特征光譜： 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

激發(fā)光譜反映了某一固定的發(fā)射波長(zhǎng)下所測(cè)量的熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的依賴(lài)關(guān)系；

發(fā)射光譜反映了某一固定激發(fā)波長(zhǎng)下所測(cè)量的熒光的波長(zhǎng)分布。

激發(fā)光譜和熒(磷)光光譜

熒光光譜能夠提供激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振度等信息，熒光分析定性和定量的基礎(chǔ)。

熒光光譜的特點(diǎn)：

（1）Stokes位移。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間有波長(zhǎng)差，發(fā)射光譜波長(zhǎng)比激發(fā)光譜波長(zhǎng)長(zhǎng)；

（2）發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；

（3）鏡像規(guī)則，熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。

4、熒光壽命

熒光物質(zhì)具有兩個(gè)重要的發(fā)光參數(shù)： 熒光壽命和 熒光量子產(chǎn)率。

熒光壽命（τ）是指當(dāng)激發(fā)停止后，分子的熒光強(qiáng)度降到激發(fā)時(shí)最大強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間，它表示粒子在激發(fā)態(tài)存在的平均時(shí)間，通常稱(chēng)為激發(fā)態(tài)的熒光壽命。與穩(wěn)態(tài)熒光提供一個(gè)平均信號(hào)不同，熒光壽命提供的是激發(fā)態(tài)分子的信息，前者可以告訴你事情發(fā)生了，而后者可以告訴你為什么發(fā)生。

熒光壽命示意圖

熒光壽命與物質(zhì)所處微環(huán)境的極性、黏度等有關(guān)，可以通過(guò)熒光壽命分析直接了解所研究體系發(fā)生的變化。熒光現(xiàn)象多發(fā)生在納秒級(jí)，這正好是分子運(yùn)動(dòng)所發(fā)生的的時(shí)間尺度，因此利用熒光技術(shù)可以“看”到許多復(fù)雜的分子間作用過(guò)程，例如超分子體系中分子間的簇集、固液界面上吸附態(tài)高分子的構(gòu)象重排、蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化等。熒光壽命分析在光伏、法醫(yī)分析、生物分子、納米結(jié)構(gòu)、量子點(diǎn)、光敏作用、鑭系元素、光動(dòng)力治療等領(lǐng)域均有應(yīng)用。

熒光壽命的測(cè)定技術(shù) 有時(shí)間分辨單光計(jì)數(shù)技術(shù)(TCSPC)、相調(diào)法、閃頻法。其中TCSPC具有靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、系統(tǒng)誤差小的優(yōu)點(diǎn)，是目前最流行的的熒光壽命測(cè)定方法。

5、熒光量子產(chǎn)率

熒光量子產(chǎn)率（φf ）是熒光物質(zhì)另一個(gè)基本參數(shù)，它表示物質(zhì)發(fā)生熒光的能力，數(shù)值在0~1之間。熒光量子效率是 熒光輻射與其他輻射和非輻射躍遷競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。

式中， kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)， ∑k i 為其他有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)總和。一般來(lái)說(shuō)， k f 主要決定于化學(xué)結(jié)構(gòu)，而 ∑ki主要決定于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

6、分子結(jié)構(gòu)與熒光

并不是所有的分子都能產(chǎn)生熒光，分子產(chǎn)生熒光必須具有：合適的結(jié)構(gòu)和一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系如下：

（1）電子躍遷類(lèi)型。大多數(shù)熒光化合物都是由π→π*或n→π*躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他非輻射躍遷，在發(fā)生π*→π或π*→n躍遷而產(chǎn)生熒光，其中π*→π熒光效率最高。

（2）共軛效應(yīng)。含有π*→π躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最常見(jiàn)且最強(qiáng)。具有較大共軛體系或脂環(huán)羰基結(jié)構(gòu)的脂肪族化合物也可能產(chǎn)生熒光。

（3）取代基效應(yīng)。苯環(huán)上有吸電子基常常會(huì)妨礙熒光的產(chǎn)生，而給電子基會(huì)使熒光增強(qiáng)。

（4）平面剛性結(jié)構(gòu)。具有平面剛性結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子大多具有強(qiáng)烈熒光，因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用。

三、熒光分析

熒光分析就是基于物質(zhì)的光致發(fā)光現(xiàn)象而產(chǎn)生的熒光的特性及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量的分析方法。目前，也廣泛地作為一種表征技術(shù)來(lái)研究體系的物理、化學(xué)性質(zhì)及其變化情況，例如生物大分子構(gòu)象及性質(zhì)的研究。

熒光光譜適用于固體粉末、晶體、薄膜、液體等樣品的分析。根據(jù)樣品分別選配石英池（液體樣品）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）。

熒光分析的優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高；（2）選擇性強(qiáng)；（3）試樣量少、方法簡(jiǎn)單；（4）提供較多的物理參數(shù)。但是也存在應(yīng)用范圍不夠廣泛、對(duì)環(huán)境敏感（干擾因素多）等缺點(diǎn)。

1、定性分析

不同結(jié)構(gòu)熒光化合物都有特征的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可以將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的形狀、峰位與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖進(jìn)行比較，從而達(dá)到定性分析的目的。

2、定量分析

在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比：F=Kc。其中，F(xiàn)為熒光強(qiáng)度，c為熒光物質(zhì)濃度，K為比例系數(shù)。這就是熒光光譜定量分析的依據(jù)。

上述關(guān)系不適用于熒光物質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)，熒光物質(zhì)濃度過(guò)高，其熒光強(qiáng)度反而降低。原因有：

（1）內(nèi)濾效應(yīng)。一是，當(dāng)溶液濃度過(guò)高時(shí)，溶液中雜質(zhì)對(duì)入射光的吸收作用增大，相當(dāng)于降低了激發(fā)光的強(qiáng)度。二是，濃度過(guò)高時(shí)，入射光被液池前部的熒光物質(zhì)強(qiáng)烈吸收，處于液池中、后部的熒光物質(zhì)，則因受到入射光大大減弱而使熒光強(qiáng)度大大降低；而儀器的探測(cè)窗口通常對(duì)準(zhǔn)液池中部，從而導(dǎo)致檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度大大降低。

（2）相互作用。較高濃度溶液中，可發(fā)生溶質(zhì)間的相互作用，產(chǎn)生熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子與其基態(tài)分子的二聚物或其他溶質(zhì)分子的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光光譜的改變和/或熒光強(qiáng)度下降。當(dāng)濃度更大時(shí)，甚至?xí)纬蔁晒馕镔|(zhì)的基態(tài)分子聚集體，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度更嚴(yán)重下降。

（3）自淬滅。熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜與其吸收光譜呈現(xiàn)重疊，便可能發(fā)生所發(fā)射的熒光被部分再吸收的現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。溶液濃度增大時(shí)會(huì)促使再吸收現(xiàn)象加劇。

3、影響熒光強(qiáng)度的外部因素