石蠟包埋組織樣品制備方法

組織采集后，經(jīng)固定、保存、石蠟包埋、切片、展片、烤片，方可進行HE染色（或其它化學染料染色）及免疫抗體標記。以下操作依據(jù)組織大小及致密程度而定

1、組織的采集、固定和保存：

可依據(jù)實驗目的及組織的特點而考慮采用不同的固定和保存方法。此處只介紹實驗室常用方法。

采取組織后，4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小時（根據(jù)組織大小和致密程度調(diào)整固定時間）或過夜，PBS緩沖液洗三次，每次10min至1小時，于30%、50%乙醇中各10 min至1小時，4C保存于70%乙醇中。

2、組織的包埋、切片、展片及保存：

固定后的樣品經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，52-54C石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚4 -10m，貼于處理過的干凈載玻片上，34C烤片過夜，之后收集于載片盒中，4C密封保存。

石蠟包埋：

保存于4C 70%乙醇中的組織樣品

80%乙醇   15 min

95%乙醇 15 min     

100%乙醇   15min 2

1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

二甲苯透明   5-10 min

1/2二甲苯1/2石蠟 30 min

石蠟（1）   1.5hr

石蠟（2）   1.5-2.5hr

石蠟（3）   包埋

4C保存

3、石蠟組織切片的免疫標記：

切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水，即可進行免疫反應，操作步驟與冰凍組織切片的反應方法相同。

石蠟組織切片脫蠟、復水步驟：

密封保存于4C的組織切片

二甲苯(1)   10 min

二甲苯(2)   10 min

二甲苯(3)   10 min

1/2二甲苯1/2乙醇   15 min

100%乙醇   5 min

95%乙醇   5 min

80%乙醇   5 min

70%乙醇5 min

50%乙醇   5 min

30%乙醇   5 min

d2H2O   5 min

4、石蠟組織切片的HE染色：

切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水，于蘇木精中室溫染色5-20 min，迅速用水沖洗切片，至組織切片變藍，鏡檢。用0.1-0.5%鹽酸乙醇分色1～2秒鐘，也可用50ml H2O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分色步驟）。之后用流水沖洗切片，直至切片變藍，此稱藍化。切片經(jīng)梯度乙醇至95%乙醇中，于0.5%伊紅中染色1～5秒或更長時間，95%乙醇洗去殘色，若顏色太深，可在低濃度的乙醇中脫色，鏡檢。無水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。普通光鏡觀察，室溫干燥條件下保存染色切片。

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水

蘇木精 室溫5-10 min

H2O   迅速沖洗

0.1%鹽酸乙醇   1-2 sec

流水滴洗

30%乙醇   1 min

50%乙醇   1 min

70%乙醇   1 min

80%乙醇   1 min

95%乙醇   1 min

伊紅A液   1min

伊紅B液   1-30sec

無水乙醇   1 min

無水乙醇   5min 2

1/2乙醇1/2二甲苯   15 min

二甲苯(1)   5min

二甲苯(2)   5min

二甲苯(3)   5min

中性樹膠封片，室溫干燥保存