什么是UPLC？和HPLC有什么區(qū)別？

UPLC：超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography）

色譜理論認(rèn)為提高色譜柱的效能（efficiency）就能增加儀器的解析度（resolution），而運用粒徑低于2μm的小顆粒無疑是增加效能的好方法。但減小固定相的粒度以增加色譜柱效能一直的色譜儀器科學(xué)的瓶頸，因為小顆粒不僅要求系統(tǒng)能承受高于目前極限壓力（比如9000psi），需要更小的系統(tǒng)體積（死體積），并且需要能適應(yīng)可能只有幾秒峰寬的高速檢測器。

UHPLC：超高效液相色譜 (Ultra-High Performance Liquid Chromatography)

特點是工作壓力超過6000 psi或工作溫度超過環(huán)境溫度的應(yīng)用。由于 UHPLC 應(yīng)用中使用的硬件通?？梢猿惺?9000 psi或更高的系統(tǒng)壓力，因此色譜工作人員可以使用由更高級固相（其顆粒遠遠小于傳統(tǒng)的5 μm直徑硅膠）填充的色譜柱。采用顆粒更小的固相不僅可以實現(xiàn)更高的分辨率，同時還能縮短整體分析時間。

HPLC：高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography）

又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。

以下幾幅圖更直觀的告訴我們區(qū)別何在：

UPLC和HPLC的區(qū)別

與傳統(tǒng)的高效液相色譜(HPLC)相比，UPLC具有高分離度(ultra resolution)、高速度(ultra speed)、高靈敏度(sensitivity)等優(yōu)勢。在全面提升HPLC的速度、靈敏度和分離度諸品質(zhì)的同時，保留其原有的實用性及原理。

其最顯著的優(yōu)勢是可以縮短分析時間，提高工作效率。

使用UPLC確實能明顯縮短分析時間，提高效率（如某有關(guān)物質(zhì)分析方法，使用HPLC運行一針是75分鐘，UPLC完全可以在10分鐘內(nèi)搞定），分析效率提高將近7.5倍。

當(dāng)然了，分析效率提高這么多，其配套設(shè)備肯定也不是鬧著玩的。UPLC需要小顆粒雜化填料（1.7um）的色譜柱、更高耐壓（達15000Psi）、低系統(tǒng)體積的輸液單元。

學(xué)會正確維護UPLC，避免被領(lǐng)導(dǎo)罵。

溶液的制備很關(guān)鍵

在色譜系統(tǒng)中，溶液是一個更重要的部分，那么UPLC中溶液的制備應(yīng)該是怎樣的呢？

樣品溶液的制備

樣品的制備同樣是過濾和離心兩種方法。

過濾：根據(jù)樣品溶液的極性，選擇不同材質(zhì)的0.22um濾膜過濾。

濾膜的選擇，要進行分析方法確證，濾膜的相容性實驗。

此處強調(diào)一下，必須是0.22um，千萬不要用錯。

離心：采用高速離心的方式（大于10000轉(zhuǎn)/分鐘）。

離心的方法一般適用于過濾較困難的溶液，為了保護UPLC的系統(tǒng)，離心完畢后建議再次進行過濾。

流動相的制備

所用有機相應(yīng)是進口的色譜級別。使用的水應(yīng)為超純水，MILLI-Q純水機生產(chǎn)的即可。

配制緩沖鹽溶液應(yīng)該有效期的規(guī)定，根據(jù)各實驗室SOP規(guī)定。

所有的流動相用前必須使用0.22um的微孔濾膜過濾。

有很多同仁在平衡色譜柱時，因為使用的是甲醇/水或是乙腈/水系統(tǒng)，因為不涉及到緩沖鹽溶液，經(jīng)常把過濾這一步省略，再次提醒大家：

UPLC系統(tǒng)使用的所有流動相均必須經(jīng)過0.22um的微孔濾膜過濾。

色譜柱的使用

若柱效不佳，將會浪費樣品分析時間，問題排查時間，更是浪費寶貴樣品。所以色譜柱的使用操作的規(guī)范性，直接決定UPLC的分析效率與數(shù)據(jù)可靠性。

首先，應(yīng)與色譜柱的供應(yīng)商溝通，充分了解色譜柱的性能，如反相柱、正相柱、氰基柱、親水柱、離子交換柱等。

再次，建立色譜柱的管理SOP，在SOP中規(guī)定色譜柱的登記、啟用、使用及報廢記錄，便于色譜柱整個生命周期的管理。

色譜柱的啟用

色譜柱包裝開啟后一定要閱讀說明書，關(guān)注說明書中的注意事項，如pH的適用范圍、流動相中能否采用水、平衡時的流速，保留溶劑等。

對于正相色譜柱來說，最重點的時注意初始流速一定要小，一般0.2ml/min。

反相柱就比較麻煩一點了，先用小流速0.2ml/min的甲醇沖洗2小時，再用10%甲醇沖洗2小時，最后過渡到檢品的流動相，流速由低逐步增加到目標(biāo)流速。

柱子開始使用前，必須確認(rèn)系統(tǒng)適用性測試是否滿足要求，主要關(guān)注理論板數(shù)、分離度、拖尾因子等關(guān)鍵分離參數(shù)，驗收合格后才能使用。

色譜柱的清洗和保存

正相色譜柱進樣后一般無需刻意清洗，但是需要保存時，必須按照說明書要求選擇溶劑，以免長時間引起固定相干涸。

反相色譜柱清洗過程：高水相等度洗脫保證緩沖鹽沖洗干凈后，梯度洗脫的方式過渡到純有機相，等度洗脫10~30柱體積，柱溫可適當(dāng)提高2~5度，方法運行完及時關(guān)閉柱溫。

對于親水作用色譜柱：最后保存盡量避免使用純有機相，應(yīng)包含少量的水，比如95%的乙腈。

色譜柱的使用

使用色譜柱，應(yīng)輕拿輕放，安裝零死體積。

切忌由大流速變化引起的壓力變化對色譜柱造成機械損傷，應(yīng)使用逐漸提高流速的方法達到目標(biāo)流速。

建立色譜柱的使用記錄，記錄中體現(xiàn)出理論板數(shù)、分離度拖尾因子、柱壓、保留時間、流動相體系、保存溶劑等信息，一旦發(fā)現(xiàn)參數(shù)異常，以便展開調(diào)查，避免偏差發(fā)生。

色譜柱使用過程中，應(yīng)關(guān)注其柱壓、柱效，使用完畢后填寫“色譜使用記錄”。

色譜柱最好是專用，帶保護柱。并且使用過緩沖鹽的色譜柱最好不要用于新項目的方法開發(fā)。

低紫外區(qū)的檢測，為了避免“鬼峰”的出現(xiàn)，可以使用捕集柱，色譜柱使用完畢后一定要按SOP及時清洗。

對于鬼峰捕集柱的使用，很多科研單位覺得不可行，不知道如何在標(biāo)準(zhǔn)中進行表達。其實在方法建立過程中，如果鬼峰無法避免，可以在“發(fā)展報告”中說明使用鬼峰捕集柱的理由，并在標(biāo)準(zhǔn)中如實描述，以便與廠家或是QC進行方法轉(zhuǎn)移。

有關(guān)親水性色譜柱，小編也有些提議：

以HILIK色譜柱為例，使用更少或是較弱的極性溶劑可以增加極性化合物的保留。

樣品溶解的溶液盡可能接近流動相條件的初始條件，然而，極性大的分析物經(jīng)常在有機溶液中存在溶解度較低的現(xiàn)象，可以先用水溶解樣品，再用乙腈/水溶液進行稀釋，需要平衡溶解度和峰形之間的關(guān)系，根據(jù)化合物性質(zhì)，具體情況具體分析。

色譜柱的報廢要素

1.色譜柱堵塞，壓力升高1000psi。

2.色譜柱污染出現(xiàn)鬼峰、噪音增加、檢測限增大時。

3.填料塌陷或污染引起色譜圖前沿、拖尾、分叉時。

4.理論板數(shù)、分離度、拖尾因子按各檢品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行，未規(guī)定的按各國藥典通則規(guī)定執(zhí)行，不符合上述規(guī)定時。

UPLC使用常見問題

液相基線噪音干擾

如果出現(xiàn)基線噪音較大的情況，首先應(yīng)該排除檢測器的問題。

步驟如下：

排查流動相問題時，需要重點考慮流動相的組成及檢測波長是否發(fā)生了改變？

一定要確定您所用儀器上最后使用的流動相是什么？為了避免這個問題，在接上個人用儀器之前，要連接兩通，用超純水將儀器管路全部清洗一遍。

此外還需要考慮流動相的互溶性的問題。不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當(dāng)有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，為了保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辯證溶劑雜質(zhì)峰。

分析弱酸性樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

流動相中加入有機胺可以減弱弱堿性樣品和殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在此使用的有機胺也成為減尾劑。

要確保所使用流動相不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

即使經(jīng)過0.22um濾膜過濾，在保質(zhì)期時間內(nèi)，有的流動相仍會存在長菌、沉淀、結(jié)晶等現(xiàn)象。

流動相不干凈，進入液相系統(tǒng)是非常危險的，尤其是緩沖鹽。

在此有一個小竅門：用激光筆測試，不干凈的緩沖鹽溶液在激光筆照射時，里面會看到一條紅線。

最后，還有濾膜的相容性問題，有的濾膜可以引起基線及噪音的波動，遇到這種情況，需要進行濾膜篩選。

液相壓力波動

最常見原因是泵內(nèi)有氣泡。

其他還有：

溶劑進口過濾芯堵塞（最好更換新的過濾芯，一旦長菌，是不可逆的）、未充分混勻（尤其是有機相和水相相差比例懸殊時）、溶劑未脫氣、泵的密封墊老化、出口單向閥實效、主動閥失效等。

液相壓力過低包含原因

首先想到的是連接管路泄露或其他設(shè)備不密封，如泵頭密封墊。

還會存在溶劑進口過濾芯堵塞，溶劑無法通過、溶劑或流速改變、主/被動閥失靈、

四元比例閥失靈、單向出口閥失靈、色譜柱固定相流失等原因。

液相壓力過高包含原因

這個原因各位同仁應(yīng)該都很熟悉，如：色譜柱污染、柱子進口過濾芯被污染、PURGE閥過濾芯污染、連接管路堵塞、進樣器旋轉(zhuǎn)密封閥被堵塞或進樣針或針座被堵塞等。

系統(tǒng)優(yōu)化時所需過度溶劑

1.反相和正相相互轉(zhuǎn)換：

所用溶劑為異丙醇，原因：排除系統(tǒng)中空氣的最好溶劑。

2.使用緩沖液后沖洗系統(tǒng)：

所用溶劑為二次蒸餾水，原因：再溶解緩沖液結(jié)晶的最好溶劑。

3.更換溶劑后：

所用溶劑為二次蒸餾水，原因：再溶解緩沖液結(jié)晶的最好溶劑。

儀器易損件維護時間

選擇UPLC 還是HPLC？

某網(wǎng)友：“由于所在實驗室即將添置一臺新質(zhì)譜，質(zhì)譜已經(jīng)選好了，但是在液相的選擇上很是猶豫，不知是否該買一臺UPLC。因為經(jīng)常是一次分析幾百個樣品，高速液相的速度會快一些。但是，生物樣品的前處理要求也相應(yīng)提高。而且價格也比較貴。是否需要買UPLC？還是買HPLC？想了解一下大家的使用經(jīng)驗和看法?！?/span>

相信這是很多實驗室小伙伴會面臨的選擇，那么到底該從哪些方面來衡量儀器的選型？

有人說，能用HPLC就用，多數(shù)情況下，HPLC都能hold住。UPLC肯定是大勢所趨。就像很多人所說的一樣，UPLC就像是鴉片，用過了就上癮擺脫不了。這個說法雖然極端 但是話糙理不糙，你覺得有理嗎？

網(wǎng)友支招

網(wǎng)友A：

如你所說，使用UPLC肯定能提高你分析的速度，但是不知道目前你選好的質(zhì)譜是什么型號的？這里存在一個質(zhì)譜工作站能否兼容你的液相色譜的問題，所以還請考慮仔細。

個人覺得UPLC類的快速液相是大勢所趨。

網(wǎng)友B：

個人感覺UPLC不錯，最直觀的感覺是分析時間大大縮短，這也是UPLC鼓吹的一點。但UPLC對流動相，色譜柱，樣品前處理，質(zhì)譜接口，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)都提出了更嚴(yán)格的要求，同時帶來的液氮、乙腈等耗材的使用量下降，這個是很明顯的。至于所用的試劑、耗材等等比HPLC高級多少，我倒沒看出來。無非是要求過下0.22μm的膜。個人認(rèn)為短期內(nèi)還無法完全替代普通LC。普通液相采用細徑色譜柱是目前最成熟和經(jīng)濟的LC-MS方案。

網(wǎng)友C:

UPLC在分析速度、分離度等方面確實有優(yōu)勢，但對樣品的前處理、試劑等提出了更高的要求，樣品分析成本也高了。我們知道，影響分析速度快慢的主要步驟是樣本的前處理，而儀器分析速度的快慢不是主要因素，現(xiàn)在儀器都是自動進樣加24小時開機，測定一個樣品多花點時間能有多大影響，很多人那UPLC分析速度快來說事是不合適的。我的行業(yè)測定的是食品樣品，從我的經(jīng)驗來看，我更喜歡用普通的HPLC。

網(wǎng)友D：

我是做中藥成分的，個人覺得還是uplc更好一些。因為是與質(zhì)譜聯(lián)用，日常分析中的樣品如果成分比較復(fù)雜的話，普通液相的色譜條件就不太好找，必然會經(jīng)常遇到需要加酸、堿或緩沖鹽的情況，尤其是緩沖鹽的選擇受質(zhì)譜的限制較大。而uplc由于柱效高，分離效果要比普通液相高的多，在很多時候普通液相上加緩沖鹽也很難分離的成分，在uplc上什么都不用加就可以分開，而且效果很好。所以覺得uplc在聯(lián)用時更方便一些。

網(wǎng)友E：

個人認(rèn)為，如果追求分析速度的話可以選用UPLC，如果考慮的是分析成本的話，還是用HPLC。如果樣品量大，分離簡單，則可以配UPLC。UPLC配質(zhì)譜的好處主要在于處理量大，不要把希望寄托在它分離效果好上。一種又快又好又穩(wěn)定的儀器太難找了。

網(wǎng)友F：

高通量生物分析如果樣品量大或食品類樣品比較多，建議你不要配UPLC，否則會后悔的。UPLC一般適用于研究性質(zhì)的實驗或樣品基質(zhì)比較干凈的實驗。

網(wǎng)友G:各人覺得你要是做生物樣品或者醫(yī)藥方面的UPLC還是有優(yōu)勢的，但是你如果是做殘留分析，比如農(nóng)殘，獸殘什么的就買HPLC就好，UPLC的確是快，但是食品蔬菜什么的基質(zhì)比較復(fù)雜的你就甭想分離的很好，分離效果差很多的。

網(wǎng)友H：

個人意見，如果做生物樣品分析，而且每天分析樣品量比較大，不建議使用UPLC。UPLC的優(yōu)點是分離度高，峰形尖銳。但是其填料粒徑太小，在高通量生物分析時很容易堵柱子（UPLC柱價格比較貴），使用壽命比HPLC柱少很多。另外其峰形尖銳，與掃描型質(zhì)譜聯(lián)用會降低分析物的靈敏度。

網(wǎng)友I：

如果條件允許的話還是買UPLC吧，我們也是樣品量很大，如果用hplc可能的跑上一天也不一定打完全部樣品，但是用uplc三個小時左右就能打35-40針，還能讓儀器休息一下，好好的沖洗系統(tǒng)，如果是用hplc的話估計向我們這么大的樣品量，儀器早晚的罷工。再有就是用uplc同時降低了開發(fā)方法的時間，提高了工作效率，同時還能省下不少的溶劑，正如waters的廣告所說的，在乙腈比較昂貴的時候確實能省不少錢，我們500ml的乙腈能走大約上百針樣品（梯度洗脫）。主要是效率高，也提高了靈敏度，峰形好，當(dāng)然儀器也貴些，好東西，貴點也值得，等你用熟了再用hplc，你就會感覺很不爽，原因我就不說了！就看樓主怎么權(quán)衡了！

這么多網(wǎng)友支招，大家是否在面對選擇UPLC還是HPLC時，不再猶豫了呢，其實，鑠思百檢測小編認(rèn)為，選擇哪種儀器，最主要還是要看需求和預(yù)算，總的來說，HPLC相比UPLC更加經(jīng)濟，不管是儀器本身的價格，還是使用耗材的價格，而且能夠滿足多數(shù)實驗室的一般檢測需求。至于UPLC其使用體驗的確好過HPLC，關(guān)于使用要求來說，其實沒那么多問題，只要養(yǎng)成良好的使用維護習(xí)慣，也沒啥大不了。套用肖博士的一句話：UPLC可以干HPLC的活兒，但是反過來咋辦？

鑠思百檢測可提供高效液相色譜檢測服務(wù)！