X熒光光譜分析介紹

熒光光譜

根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度鑒定物質(zhì)并測定物質(zhì)含量的方法稱為熒光分析法，根據(jù)光源的不同，熒光可分為X射線熒光(X-ray fluorometry)、原子熒光法(Atomic Fluorometry)、分子熒光法(Molecular Fluorometry)。

1、 熒光光譜的基本原理

（1）分子熒光光譜的產(chǎn)生

a、分子的能級包括：電子能級（10ev）、振動能級(0.1ev)及轉(zhuǎn)動能級(0.001ev)。

b、電子能級的多樣性               

單重態(tài)（singlet state):總自旋S=0，兩個電子自旋相反，M=2S+1=1

三重態(tài)（triplet state):總自旋S=1，兩個電子自旋方向平行，M=2S+1=3

躍遷類型的比較

（2）熒光的產(chǎn)生

處于激發(fā)態(tài)的分子返回到基態(tài)共有以下幾種途徑：

a、振動馳豫（vibrationalrelexation)：

特點：發(fā)生在同一個激發(fā)態(tài)的電子能級上；時間約10-12秒。

b、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（internal conversion)：

特點：兩個電子的能級非常靠近以致其振動能級有重疊時內(nèi)部轉(zhuǎn)換易發(fā)生。10-1~10-13秒可完成。

c、外部能量轉(zhuǎn)換（external conversion)：

特點：發(fā)生分子與分子的碰撞時；時間約10-9~10-7秒。

d、體系間跨越（intersystem crossing)：

特點：振動能級重迭時，產(chǎn)生體系間跨越的可能大;跨越后，熒光量子減弱,甚至?xí)晒庀纭?br />

e、熒光（Fluorescence)：

特點：熒光的能量小于所吸收的紫外光的能量，故發(fā)射熒光的波長比吸收的紫外光波長更長；時間約為10-9~10-7。

f、磷光（Phosphorescence)：

特點：磷光能量比熒光小，波長比熒光長;發(fā)射時間長,約為10-4~10秒（原因是分子激發(fā)三重態(tài)的壽命較長）。

熒光和磷光產(chǎn)生的示意圖

（3）無輻射躍遷與光致發(fā)光

a、無輻射躍遷：

▲最常見的無輻射躍遷有：振動遲豫、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換、外部能量轉(zhuǎn)換和體系間跨越。

b、光致發(fā)光：

▲最常見的兩種光致發(fā)光：熒光和磷光。

（4）激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

a、激發(fā)光譜（excitation spectrum)

b、發(fā)射光譜（emission spectrum)

硫酸奎寧的激發(fā)光譜(a)和發(fā)射光譜（b)

（5）熒光光譜的特點a、斯托克斯位移（Stocks shift)：熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光波長。原因：激發(fā)態(tài)分子由于內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換和振動馳豫過程而迅速到達S1*電子態(tài)的最低振動能級，從而存在著無輻射能量損失。b、熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。原因：熒光發(fā)射發(fā)生于第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級，與分子激發(fā)至那一個電子能級無關(guān)（即使分子激發(fā)到高于S1*的電子態(tài)的更高振動能級，可通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動馳豫等無輻射躍遷的形式釋放能量回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級）。c、熒光光譜與激發(fā)光譜呈對稱鏡像關(guān)系。

2、 分子熒光光譜法的特點

（1）靈敏度高

（2）選擇性強

（3）樣品用量少

（4）信息量豐富

（5）方便、快捷

（6）環(huán)保

3、 分子熒光光譜的主要應(yīng)用

（1）在生物領(lǐng)域的應(yīng)用該領(lǐng)域主要用于臨床測定生物樣品中某些成分的含量，生物技術(shù)及免疫技術(shù)的分析等，如脫氧核糖和脫氧核糖核酸的含量測定、DNA、抗體、抗原等各方面的研究。在此領(lǐng)域中主要時利用各種熒光探針進行分析檢測，主要分為生物納米熒光探針和生物非納米熒光探針。

（2）在食品領(lǐng)域的應(yīng)用該領(lǐng)域主要用于食品中礦物質(zhì)及金屬元素、氨基酸、維生素、菌類污染、添加劑、防腐劑、食品包裝有害物質(zhì)、農(nóng)藥殘留等的分析檢測。特別是與HPLC、TLC、FIA等技術(shù)的結(jié)合可以更好的達到食品中各種物質(zhì)的檢測效果。

（3）分子熒光光譜在藥物分析中的應(yīng)用藥物分析領(lǐng)域可以利用熒光分析進行藥物的有效成分鑒定、藥物代謝動力學(xué)研究、臨床藥理藥效分析等。藥物熒光分析可以分為三類：直接熒光分析、間接熒光分析和納米熒光分析。

（4）分子熒光光譜在環(huán)境分析中的應(yīng)用該領(lǐng)域主要利用熒光分析檢測環(huán)境中的物質(zhì)的含量，主要是對水體、礦石和土壤進行檢測。

4、 熒光定量分析方法由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光法很少用來定性分析。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣相同的處理之后，配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定這些溶液的熒光強度，以熒光強度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。

（2）比例法取已知量的純凈熒光物質(zhì)配一標(biāo)液，使?jié)舛仍诰€性范圍內(nèi)，測Fs。同樣條件下測試樣Fx(若空白液的熒光強度調(diào)不到0%時，應(yīng)扣除空白F0）。