透射電鏡超薄切片和染色實驗的區(qū)別

透射電鏡超薄切片和染色實驗步驟

1、取材

根據(jù)所取的標(biāo)本數(shù)量準(zhǔn)備好潔凈的小瓶（瓶子必須經(jīng)過嚴(yán)格的洗滌），在每只瓶上貼好標(biāo)簽或編號，瓶內(nèi)注入 4 ℃ 固定液 1~2 ml。另外準(zhǔn)備好潔凈的載玻片及手術(shù)刀片及少量冰塊，將載玻片置于冰塊上。組織離體后立即置于載玻片上，并滴上幾滴 4 ℃ 的固定液，再用鋒利的刀片將組織切成 0.5~1 mm3 的小塊，并立即投入到固定液中置于 4 ℃ 冰箱中固定。

2、固定

固定方法有物理的和化學(xué)的兩種。前者系采用冰凍、微波照射、臨界點干燥等手段來保存細胞結(jié)構(gòu)；后者是用一定的化學(xué)試劑來固定細胞的結(jié)構(gòu)，這些化學(xué)試劑稱固定劑，它能與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)合形成交聯(lián)，從而穩(wěn)定細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，并能使脂肪、糖類保持生活時的狀態(tài)和位置，將精細的形態(tài)結(jié)構(gòu)保存下來。組織通常多采用化學(xué)方法固定。

3、染色

在干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)放置蠟板或經(jīng)熔化的石蠟浸過的濾紙，將醋酸鈾染液滴在蠟板或用浸過的濾紙上，將撈有切片的載網(wǎng)覆于染液上（切片面接觸染液）染 15~30 min，用雙蒸水沖洗切片、用濾紙吸干、再將載網(wǎng)覆于檸檬酸鉛染液上，染 5~10 min，用雙蒸水沖洗切片，吸干，放入潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)備用，電鏡檢查。

注意事項

1、對一般的動物組織取材的要求如下：
1）標(biāo)本材料要新鮮，取材速度要快：由于生物組織離體后，細胞將會立即釋放出各種水解酶而引起細胞自溶，使其微細結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而產(chǎn)生假象，故要盡量保持材料的新鮮，經(jīng)解剖、手術(shù)或活檢取材后迅速投入固定液內(nèi)，以盡量保持細胞在活體狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。

2）取材小，取材部位要準(zhǔn)確：由于用于電鏡標(biāo)本制備的固定液其滲透速度極慢，同時超薄切片的面積又很小，一般取材不超過 0.5~1 mm3，故取材時必須注意取材部位。如取材部位不當(dāng)，則無法獲得預(yù)期的結(jié)果。

3）所用的固定液及器材都必須預(yù)冷，以盡可能降低離體細胞內(nèi)水解酶的活性，減少細胞自溶，一般均將固定液保存于 4 ℃ 冰箱內(nèi)，取材用的剪刀或手術(shù)刀片及載玻片可置于冰塊上預(yù)冷。

4）切割組織的刀、剪必須很鋒利，操作時避免拉、扯、鋸、壓等動作所造成的機械損傷。如果標(biāo)本是病毒的分離培養(yǎng)物，則必須注意其數(shù)量、濃度。這種培養(yǎng)物取材后可用塑料離心管離心取其沉淀物，其量在離心沉淀后必須有米粒大小，如量太少，則無法進行以后的操作。

2、取材的正確與否將與所制備的標(biāo)本能否符合觀察要求密切相關(guān)，是超薄切片技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3、固定目的：

① 盡膚保持細胞的結(jié)構(gòu)在活體狀態(tài)；

② 在固定以后的漂洗、脫水和包埋時，保持細胞成份不致流失和溶解，并使組織適當(dāng)?shù)挠不?，使組織細胞內(nèi)各種物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)改變最??；

③ 為標(biāo)本以后的處理過程（包括染色和經(jīng)受電子束轟擊）作準(zhǔn)備。

4、幾種常用固定劑:

1）鋨酸（Osmium tetroxide, OsO4）鋨酸即四氧化鋨，是淡黃色塊狀或針狀結(jié)晶，熔點 40~41 ℃，分子量 254.2，溶于水、酒精、乙醚及氯仿。它的蒸汽有強烈刺激性，對人眼、鼻、喉粘膜有毒性作用，操作時應(yīng)注意防護，最好在通風(fēng)柜內(nèi)操作。鋨酸為強氧化劑，對氮具有極大的親和力，能與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)成份而不產(chǎn)生沉淀。它對脂類有良好的保護作用，能與不飽和脂肪酸鏈結(jié)合，形成復(fù)合物，是唯一能固定脂類的固定劑。此外，高密度的金屬餓與被固定的組織成分結(jié)合，受到電子束照射時能散射大量電子，使圖像反差增大，起到「電子染色」的作用。鋨酸固定可避免組織塊收縮或膨脹，使組織塊軟硬適度，利于制作超薄切片。鋨酸的主要缺點是分子較大，對組織的滲透速度緩慢（0.1~0.3 mm/h）易產(chǎn)生固定不均勻，因此要求組織塊體積不超過 1 mm3。鋨酸對碳水化合物類固定效果不佳，使酶活性喪失較多，也會破壞抗原性，因此不宜用于酶細胞化學(xué)和免疫細胞化學(xué)研究。鋨酸固定液的濃度為 1%，固定時間為 1~4 h，比如固定單層培養(yǎng)細胞則為 15~30 min。

2）戊二醛 (Glutaraldehyde, C5 H8O2)：分子量為 100、12。沸點 73~75 ℃，吸收光譜為 280 nm。市售戊二醛為 25% 或 50% 的水溶液，其 pH 為 4.0~5.0。多采用電鏡專用的精制戊二醛，長期貯存的戊二醛可因高溫、氧氣、中性或堿性 pH 發(fā)生聚合而失去醛基，固定效力也明顯降低，故戊二醛原液應(yīng)保存于低溫處。已配制的戊二醛于 4 ℃ 保存。應(yīng)盡量使用新鮮配制的戊二醛固定液。戊二醛對組織滲透力強，固定速度快（0.4 mm/h）對細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有活躍的親和力，特別是對細胞內(nèi)某些易變的結(jié)構(gòu)，如微管、有絲分裂的紡錘絲以及細胞基質(zhì)有較好的固定作用，它和蛋白質(zhì)及氨基酸的反應(yīng)是在溶液中通過與組織和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，而使細胞成分得以穩(wěn)定。它能保存糖原，固定核蛋白，能保存酶的活性，適用于細胞化學(xué)研究。戊二醛的另一優(yōu)點是，被戊二醛固定的組織塊可在固定液中保存較長時間（數(shù)周甚至 1~2 個月）而不致有任何超微結(jié)構(gòu)的改變這尤其適宜于遠距離以外臨床、實驗室或野外現(xiàn)場的取材保存。但戊二醛也非理想的固定劑，它不能保存脂肪，無電子染色作用，不能增加圖像反差，且對緩沖液滲透壓要求較高。

5、目前固定大多采用戊二醛與鋨酸雙固定法，戊二醛作預(yù)固定，鋨酸作后固定，互相取長補短，固定效果較好。經(jīng)戊二醛固定的組織須用緩沖液反復(fù)漂洗，否則殘留的戊二醛會影響鋨酸的滲透固定。戊二酸固定液的濃度微 1%~5%，固定時間為 0.5~2 h。

6、目前，電鏡常用的超薄切片染色劑是鈾鹽和鉛鹽。鈾可與大多數(shù)細胞成分結(jié)合，特別易與核酸結(jié)合，而且染色較細致、真實、不易出現(xiàn)沉淀顆粒，但鈾具有放射性，使用時要特別注意。鉛對細胞和組織各種結(jié)構(gòu)都有親和力，易與蛋白質(zhì)結(jié)合，尤其是對不能被四氧化鋨染色的糖原具有染色作用。但鉛染色比較麻煩，鉛易和空氣中的 CO2 結(jié)合形成不溶性的碳酸鉛沉淀，污染切片。因此，在染色時要盡量避免染色與空氣中的 CO2 接觸。一般是在加蓋的染色平皿內(nèi)放置一些 NaOH，以減少鉛與空氣中二氧化碳的接觸。

7、理想的固定劑應(yīng)具備如下條件：

① 能迅速而均勻地滲人細胞內(nèi)部，立即殺死細胞以盡量減少死后變化；

② 能穩(wěn)定各種結(jié)構(gòu)成分，以保證在后續(xù)的各種處理過程中不致溶解或流失；

③ 能保存細胞的酶活力和抗原性，以供細胞化學(xué)或免疫細胞化學(xué)的測定母，不影響細胞的收縮或膨脹，以保持各種結(jié)構(gòu)處于生活時的狀態(tài)；

④ 不出現(xiàn)人工假象或變形，以保證電鏡圖像的真實性。為了達到上述要求，還必須重視固定液的 pH 值、滲透壓及電解質(zhì)濃度等。

8、由于鈾和鉛具有不同的電子染色作用，故目前切片普遍都采用雙重染色法，即先用軸染色后，再用鉛染液染色。

9、為防止碳酸鉛沉淀的形成，可在培養(yǎng)皿內(nèi)放入幾粒固體氫氧化鈉。