SEM細(xì)菌樣品制備以及要求

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發(fā)表時(shí)間：2023-09-02 13:29作者：鑠思百檢測(cè)

掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)測(cè)試樣品的基本要求是干燥且導(dǎo)電性好。然而，微生物、細(xì)菌樣品含水量高，導(dǎo)電性差，且容易變形。因此，對(duì)細(xì)菌微生物樣品進(jìn)行SEM測(cè)試之前需要對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的前處理。

注：本文提供的方法對(duì)其他生物樣品同樣適用。

細(xì)菌的SEM制樣步驟如下：

細(xì)菌樣品前處理

取液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h左右、旺盛生長(zhǎng)的菌體。

(1)收集菌體:①液體培養(yǎng)基中的菌體，可取培養(yǎng)液8000rpm離心3~5min，棄上清，倒入2。5%戊二醛固定液;②固體培養(yǎng)基上的菌體，可在菌落表面滴幾滴戊二醛固定液,輕刮菌落（注意不要刮下培養(yǎng)基)。將菌液吸入小離心管，離心后換入新鮮戊二醛固定。

(2) 固定：將沉淀用2.5%的戊二醛固定4 h（或4 ℃過(guò)夜），然后用0.2 M PBS緩沖液（PH=6.8）清洗3次，每次15-20min。

固定時(shí)間問(wèn)題：如果時(shí)間允許則4℃過(guò)夜，測(cè)試比較著急的情況下4 h也可以。

固定和清洗問(wèn)題：因?yàn)槭浅恋?，這里面有一個(gè)問(wèn)題是需不需要把菌分散開(kāi)來(lái)固定和清洗?？梢苑稚㈤_(kāi)，然后再離心沉淀進(jìn)行下一步處理，但是比較麻煩。也可以不分散開(kāi)，親自實(shí)驗(yàn)證明可行，對(duì)最終成像也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)太大區(qū)別。

沉淀分散問(wèn)題：在固定和清洗過(guò)程中如果沉淀自然分散開(kāi)，可以通過(guò)再離心的方式沉淀。下同。

鋨酸問(wèn)題：有些文獻(xiàn)還使用了1%的鋨酸固定，但是鋨酸劇毒且不好買，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒(méi)有。少了這步處理親自實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可行。

(3) 脫水：用30%、50%、70%、85%和95%的乙醇各處理一次，每次15-20min；再用100%乙醇處理兩次，每次15-20min。

(4) 置換：用乙酸異戊脂置換3 h以上，最好過(guò)夜。使用乙酸異戊脂的目的是使菌更飽滿，避免菌出現(xiàn)變形或者皺縮。

置換時(shí)間：有些文獻(xiàn)置換時(shí)間為15 min，時(shí)間太短，容易造成菌的變形和皺縮。必須置換3 h以上。

(5) 觀察：將樣品依次經(jīng)過(guò)二氧化碳臨界點(diǎn)干燥和離子濺射儀噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

二氧化碳臨界點(diǎn)干燥問(wèn)題：有些文獻(xiàn)使用了空氣自然干燥，或者冷凍干燥，但是如果實(shí)驗(yàn)條件允許，建議使用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥。

噴金相關(guān)問(wèn)題：噴金的目的是使樣品導(dǎo)電。微生物樣品導(dǎo)電性差，建議延長(zhǎng)噴金時(shí)間。在一般樣品噴金60 s的基礎(chǔ)上適當(dāng)增加10-20 s。噴金時(shí)間也不是越長(zhǎng)越好，因?yàn)殡S著噴金時(shí)間的增長(zhǎng)，金膜的厚度越大，對(duì)于樣品的微觀細(xì)節(jié)影響也越大。因此，需要在導(dǎo)電性和減少對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞之間平衡。

噴鉑問(wèn)題：鉑顆粒比金小，因此對(duì)樣品微觀結(jié)構(gòu)的破壞比金小，但導(dǎo)電性比金差，也比金貴。對(duì)于微生物幾微米的尺寸來(lái)說(shuō)，噴金就可以。

細(xì)菌樣品特殊制備方法;

1，固體培養(yǎng)基中的菌體

用鑷子夾一小塊蓋玻片，輕輕放在旺盛生長(zhǎng)的菌體上，粘附一定的細(xì)菌.然后用雙面膠將此蓋玻片貼在棕色瓶瓶蓋內(nèi)壁，在棕色瓶?jī)?nèi)加入適量1%餓酸，蓋上含有樣品的瓶蓋,熏蒸固定2h 以上。然后用雙面膠將蓋玻片粘在樣品臺(tái)上，噴金,進(jìn)行掃描電鏡觀察。

2，液體培養(yǎng)基中的菌體

取一定的培養(yǎng)液，8000rpm離心3~5min,棄上清液﹐加入2.5%戊二醛固定 2h,pH 7。2磷酸鹽緩沖液清洗，然后加入蒸餾水稀釋，充分混合后用滴管取混合液一滴于小塊蓋玻片上，吸附2min，用濾紙吸去多余溶液。然后用雙面膠將此蓋玻片貼在棕色瓶瓶蓋內(nèi)壁,在棕色瓶?jī)?nèi)加入適量1%餓酸,蓋上含有樣品的瓶蓋,熏蒸固定2h 以上。然后用雙面膠將蓋玻片粘在樣品臺(tái)上，噴金，進(jìn)行掃描電鏡觀察。